2003年,还在杭州艺术学校上学的叶祖新被选中出演《情断上海滩》而进入演艺圈。2005年,参演古装电视剧《李小环与苗翠花》,饰演方世玉；同年,参演古装宫斗电视剧《大清后宫》,饰演少年道光帝。2006年参演家庭伦理电视剧《死去活来》,饰演樊涛；参演古装历史电视剧《皇上二大爷》,饰演赵金山。2008年,参演战争历史电视剧《父亲的战争》,饰演彭龙。步步惊心饰演胤䄉2009年,参演古装历史电视剧《杨贵妃秘史》,饰演韦坚；同年参演家族斗争电视剧《大管家》,饰演李复修；参演战争历史电视剧《内线》,饰演苏子童。2010年,参演古装历史电视剧《大唐女巡按》,饰演欧阳；参演古装神话电视剧《活佛济公2》,分饰必清,瘦仙童两角；参演寻亲电视剧《杜鹃的女儿》,饰演小吴。2011年,参演穿越电视剧《步步惊心》,饰演十阿哥胤誐；参演古装搞笑电视剧《怪侠欧阳德》,饰演淳贝勒。2012年,参演爱情励志电视剧《错点鸳鸯》,饰演冷刚；参演传奇抗战题材电视剧《五台山抗日传奇之女尼排》,饰演任松良；参演古装历史电视剧《薛平贵与王宝钏》,饰演叶公公；参演战争历史电视剧《向着胜利前进》,饰演何医生；参演古装武侠电视剧《新白发魔女传》,饰演辛龙子；在古装历史传奇电视剧《隋唐英雄》中饰演裴元庆。犀利仁师饰范大同2014年,参演古装神话电视剧《欢天喜地俏冤家》,饰演高富帅；参演都市爱情电视剧《步步惊情》,饰演JACK；参演古装搞笑爱情电视剧《犀利仁师》,饰演范大同；参演都市爱情电视剧《说好的幸福》,饰演许诺；参演古装历史传奇电视剧《隋唐英雄4》,饰演薛丁山。2015年1月,参演《蜀山战纪之剑侠传奇》,饰演医术不凡的张馅饼；8月参演的抗日电视剧《铁在烧》在浙江,安徽卫视播出,饰演走上歧路悲剧收场的丁丑娃；9月主演的爱情喜剧电影《穷途》上映,饰演前往苗寨寻找药方的男主角邹孝宇；参演都市情感电视剧《爱情万万岁》,饰演为爱痴狂的90后新新人类金波；11月参演庄园爱情电视剧《我们的秘密》,饰演为情所苦的造型师罗仁；11月与黄世超,杨世瀚,张思帆共同演唱的电视剧《蜀山战纪》片尾曲《我就是我》单曲发布。12月主演民国动作悬疑电视剧《左眼诡事》,饰演左眼能看到鬼魂的男主角尹明涯。2016年,8月参演都市剧《一粒红尘》,饰演痴情的酒吧老板闵朗。12月,主演的青春励志偶像剧《食全食美》开机,饰演男主角打假卫士吴佑。2017年3月31日,参演的悬疑电影《嫌疑人X的献身》在中国大陆上映,饰演破案的线索人物罗淼警官。2018年9月17日,参演的现代剧《橙红年代》播出,饰演正义青年贝小帅。2019年8月,参演电视剧《我们的西南联大》,饰演青年学生叶润名。2020年1月5日,与韩庚,王晓晨等人合作主演的都市情感剧《还没爱够》在江苏卫视播出；同年4月,参演的古代传奇剧《清平乐》播出,他在剧中饰演内侍总管张茂则。2021年,参演电影《1921》。2022年,参演电视剧《青春正好》播出。2023年4月23日,领衔主演的《战火中的青春》在江苏卫视黄金档播出,优酷,爱奇艺双平台上线。9月15日,参演的电视剧《九义人》定档播出。叶祖新写真照叶祖新活动现场照叶祖新剧照
公益图册2013年3月,叶祖新参加家乡衢州认领“微心愿”行动,帮助一些困难人员达成心愿。叶祖新嘱托相关工作人员为衢州花园街道花园社区的4个困难家庭送上礼物,完成他们的心愿。2014年8月份,叶祖新参与由韩红发起的“韩红爱心-百人援青”大型公益医疗救助行动。2015年8月,叶祖新参加“韩红爱心百人援贵”大型医疗援助公益行动,到贵州省罗甸县边阳镇担任志愿者。2021年7月,通过韩红爱心慈善基金会向河南暴雨灾区捐款。